F1-X™ Next-Generation 1-Step Gibson Assembly® Master Mix

产品描述

F1-X™ 下一代吉布森组装®主混合液是一种优良的克隆试剂，旨在无缝DNA组装的效率和精度。这种即用主混合液能够单管克隆2至12个DNA片段，在复杂多片段构造上表现出色。F1-X™在吉布森组装®发明者丹·吉布森博士的指导下开发，代表了分子克隆技术的重大进展。优化后的酶混合物在所有片段计数上实现>95%的克隆效率，从简单的2片段连接到复杂的12片段组装。温度柔韧性（50-56°C）适用于通常在标准克隆方法中失败的GC富集和结构序列。主要优势包括单步流程简便、兼容未纯化PCR产物（≤20% v/v）、经济实惠的10μL反应体积，以及包含正对照DNA的全面质量控制。理想应用包括质粒构建、代谢途径组装、定点诱变、组合文库生成以及需要可靠多片段克隆的合成生物学项目。F1-X™直接以NEBuilder® HiFi为基准测试，涵盖2段、7段、9段和11段组件，性能与竞争对手相当甚至超过，同时每次反应成本降低了30%。兼容自动化液体处理系统，用于高通量克隆应用。在-20°C下保质期为12个月。 仅供研究使用。不用于诊断程序。

技术细节

工作流程：三步

三步就从碎片到验证的构造体，无需特殊装备

步骤1：合并碎片。将片段加入F1-X™母混音中，装入一管。

第二步：孵化。50°C，持续15-60分钟。

第三步：变身。直接转化为合格细胞，或使用无细胞流程（PUREfrex®无细胞蛋白合成）。

F1-X在单步组装混合物的直接比较中实现了最高的平均克隆率

多片段克隆准确率的一对一比较。F1-X™实现了78.6%的无错误克隆率，而NEBuilder® HiFi为64.3%，GeneArt™ Gibson Assembly HiFi为57.1%，Gibson组装®克隆套件为42.9%。在4片段组装且重叠40碱基对的组装中，F1-X™在所有试剂盒中平均克隆准确率最高?？寺∽既范韧ü柿Ｏ乱淮庑蛉范?，无错误克隆定义为与参考序列100%相同，计算为无错误克隆相对于测序总克隆的比例;在本次分析中，克隆准确率和无错误克隆率可互换使用。全长克隆体在牛津纳米孔测序前通过视觉遗传报告测定法预选完成。数据代表n=2个独立克隆和转化实验，每次复制测序7个菌落;误差条表示复制间的标准差?？寺⌒屎捅Ｕ娑纫览涤诠乖?，且可能随序列上下文和重叠设计而变化。Gibson Assembly®是Telesis Bio Inc.的注册商标，已授权使用。NEBuilder®是New England Biolabs， Inc.的注册商标。GeneArt™是Thermo Fisher Scientific的商标。

在不断增加的装配复杂度中保持稳定的效率和低错误率

多片段克隆的高性能和保真度。F1-X™ 在简单、单一组装步骤中实现高克隆效率、稳健的菌落计数和高保真度，实现复杂克隆反应——减少或消除多步骤组装的需求。传统的吉布森组装方法可能需要分层组装或两步协议，以实现超过4–5个片段的可接受效率。相比之下，F1-X™在测试复杂度（4、7、9和11片段）中保持了95-97%的克隆效率和高保真度。面板（a）显示了使用荧光报告系统计算的平均克隆效率，其中含有目标插入片段的克隆体表达荧光报告蛋白（效率=荧光菌落数 / 总菌落数）。还显示了每个报告器的菌落数量，表明有足够的菌落形成用于筛选，甚至多达11个片段。误差条表示n=4琼脂板象限间菌落计数的标准差。面板（b）展示了高保真度，该精度由全质粒次世代测序（NGS）测量。每个碱基测序的平均误差由NGS共识序列中的缺口、不匹配或插入数除以测序的碱基总数（构造体长度×测序克隆数）计算得出。基于制备方法估算输入DNA的理论误差率：对4和7片段组装进行PCR合成，9和11片段组装则直接克隆合成片段。误差条表示n=2个独立克隆反应与转化之间的标准差，每个复制序列7个菌落。2/58 NGS共识痕迹（3.4%）包含可能因读值质量或映射伪影导致的序列缺口，并被排除在保真度分析之外。实验方法按照F1-X用户指南的建议进行。碎片设计采用标准40碱基对重叠，以等摩尔比（每片0.02–0.04 pmol）组合，并在标准等温条件下组装（50°C，1小时）。合成DNA片段（Twist Bioscience）直接使用或在组装前通过PCR扩增。无需优化碎片比例、特殊重叠设计或多步骤组装。转化过程中，将1微升F1-X反应转化为20微升化学能力强的DH5α，再用SOC在220微升总体积中回收，然后进行电镀。请注意，克隆的效率和保真度取决于构造，且可能随序列上下文和重叠设计而变化。

 F1-X™ Next-Generation 1-Step Gibson Assembly® Master Mix

F1-X在反复冻融应力后仍能保持11片段组装性能

F1-X对反复冻融循环具有韧性。许多实验室会在常规使用中出现主混合液或不可避免的冻融事件。在一项11片段组装压力测试中，F1-X经过5次冻融循环，与新鲜主混合液相比，（a）菌落数量、（b）克隆效率（~95%）或（c）组装忠实度均无明显下降。值得注意的是，两种条件的错误率（2.7–7.8×10?? 误差/碱基对）都远低于输入合成DNA片段的错误率标准（1：7,500 bp 或 ~13 × 10??），证实F1-X组装能保持输入DNA的忠实度，而不会引入额外错误。值得注意的是，所有反应输入均为合成板直接的合成片段。虚线表示合成片段错误率，供参考。注：由于其甘油含量，F1-X在-20°C时保持液态;然而，在-20°C和室温之间循环时，试剂会反复承受模拟现实储存和操作条件的热应力。实验细节如下。转化：1微升反应为20微升化学能力强的DH5α，保存在220微升总体积中，30微升为镀基。n=2个复制，每个复制测序7个菌落;（c）中的误差条表示重复次数之间的标准差。（a）和（b）中的误差条代表n=4琼脂板象限中菌落计数的标准差。请注意，克隆的效率和保真度取决于构造，且可能随序列上下文和重叠设计而变化。

F1-X 组装产品支持无转化、同日线性DNA工作流程

F1-X生产适合无细胞应用且无需转化的组装产物。对于需要线性DNA模板的工作流程，如体外转录、游离蛋白表达或直接PCR扩增，F1-X组装产物可直接使用，无需细菌克隆。面板（a）展示了组装到扩增工作流程的概述。该方法特别适用于纳入复杂序列元素，如多重（A）尾部，这些元素在细菌宿主中难以维持。面板（b）展示了琼脂糖凝胶电泳组装产物（左）及随后的PCR扩增（右），适用于简单（1片段插入+载体）和更复杂的（3片段插入+载体）组装。通道1和通道2代表独立复制。原始组装产物显示组装中间体和未组装片段的预期阶梯;在组装后连接处进行PCR扩增后，两种条件均分化为一个预期大小的锐利1.7 kb能带，且无检测到组装错误或低分子量产物。这表明无论插入件复杂度如何，连接效率均较高。组装采用标准F1-X推荐条件，在50°C下运行15分钟。1微升未纯化组装产品直接加入Platinum™ SuperFi™ II反应（根据制造商建议设置的标准反应）进行扩增。所有构造体随后均由国家统计学会（NGS）进行序列验证，确认组装精度。这一简化的工作流程使得当天生成序列验证的线性模板，适用于无需或不希望转化的应用。一般建议简单组装（≤3个片段）组装时间为15分钟;对于复杂度较高的组装体，建议按照F1-X用户指南规定的60分钟反应时间。对于本实验来说，15分钟足够组装2片段和4片段构造。

上海宝叶生物科技有限公司

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